CFSE染料

准备和存储

储存在-20°C，避免暴露在光线下。

推荐的实验流程

提供的材料

CFSE染料（2瓶，每瓶500μg染料）

需要但未提供的材料

? 目标原代淋巴细胞的活单细胞悬浮液

? 新鲜细胞培养级二甲基亚砜（DMSO;如Sigma D2650）

? 无菌杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（1× DPBS）

? 细胞培养基，如10%胎牛血清（FBS）

? 无菌聚丙烯 15 mL 或 50 mL 锥形管

? 微量离心管或2-mL冷冻管

? 用于免疫表型或功能分析的荧光抗体（可选）

所需设备

? 配备蓝色激光的细胞仪;例如，BD FACSCanto™ II、BD LSRFortessa™、BD LSR™ II 流式细胞仪或 BD Accuri™ C6

? 离心机

? 37°C CO2 培养箱和 37oC 水浴

存储

到达后，用干燥剂储存染料粉末，并在≤-20°C下避光，直到使用。用DMSO重构后，将带有干燥剂的储备溶液储存在≤-20°C的小等分试样中。如果按照指示储存，储备溶液稳定3个月。

程序

CFSE的 吸收率为490 nm， 发射波长为520 nm。在用该试剂染色前，请确认您的流式细胞仪能够激发荧光染料并区分发出的荧光。

DMSO中CFSE染料溶液的制备

1. 通过将90μL DMSO加入一小瓶CFSE来制备10 mM CFSE染料储备溶液。通过涡旋 混合。

2. 使用适当标记的微量离心管或2-mL冷冻管制备一次性等分试样CFSE储备溶液（用户定义的体积）。

3. 用干燥剂在≤-20°C下冷冻所有等分试样，避光。

细胞的 CFSE 标记

该程序已针对标记细胞浓度为10-30×10 ^ 6个细胞/ mL的小鼠和人淋巴细胞进行了优化。检测条件可能需要针对其他细胞类型或细胞密度进行优化。

1. 解冻CFSE的10 mM储备溶液，如果先前冷冻。

2. 将细胞转移到15或50 mL聚丙烯离心管中。

3.在1× DPBS中洗涤细胞，以除去任何残留的血清蛋白。

4. 重复步骤 3。

5.将细胞以10-30×10 ^ 6个细胞/ mL的浓度在1× DPBS中将细胞 重悬到单个细胞悬浮液中。

a. 注意：避免在含叠氮化物、血清或蛋白质的缓冲液中染色，因为这些部分与游离染料结合，并可能干扰细胞的染色。

6. 将原液CFSE加入单细胞悬浮液中，以达到1-10μM的最终浓度。如有必要，在加入单细胞悬浮液之前，可以用DMSO进一步稀释储备溶液。立即涡旋。

7.将染细胞悬浮液在37°C水浴中孵育10-15分钟。

8.离心将9×原体积为1× DPBS的细胞和沉淀细胞中加入。

9.倾析上清液并轻轻混合以破坏细胞沉淀。

10. 加入10 mL含有10%FBS的完全培养基，并重复离心步骤。

11.倾析上清液并轻轻混合以破坏细胞沉淀。

12.将细胞重悬于完整培养基中，然后通过流式细胞术进行细胞培养或分析。

笔记：

通过将标记的细胞与未标记的对照细胞进行比较来确认细胞标记的亮度。

2. BD Horizon™ CFSE可用于需要用甲醛固定和用甲醇和去垢剂透化等用于BD磷流™染色（例如，类别558050，BD Phosflow™ Perm缓冲液III），细胞内细胞因子染色（例如，554714号，BD细胞固定/全™甲基化试剂盒）或转录因子染色（例如， 猫。No. 562574/562725， BD Pharmingen™ Transcription Factor Buffer Set）。

3. 通过增加初始 CFSE 染料上样浓度，可实现更高的初始染色强度。然而，与其他含有痕化染料的琥珀酰亚胺酯一样，较高的负载浓度可能导致细胞毒性增加或细胞死亡。